Forschungs- und Innovationsprojekt
Forschungs- und Innovationsprojekt zur Verticillium-Problematik bei Hopfen

Starke Welkesymptome an einer Hopfenrebe

Starke Welkesymptome an einer Hopfenrebe

Seit etwa 10 Jahren tritt in einigen Regionen der Hallertau verstärkt die Verticillium-Welke auf. Verursacht wird diese Krankheit im Hopfen vor allem durch den Bodenpilz Verticillium nonalfalfae (früher Verticillium albo-atrum zugeordnet) und seltener durch Verticillium dahliae. Daher wurden an der LfL 2008 die Forschungsarbeiten zur Verticillium-Welkeproblematik bei Hopfen wieder aufgenommen. Bei diesen Arbeiten wurden neben den sogenannten milden Welkerassen von Verticillium nonalfalfae zum ersten Mal auch aggressive Rassen in der Hallertau nachgewiesen. Sie führen bei früher als Welke-tolerant eingestuften Hopfensorten zu deutlichen Welkesymptomen und zum Absterben der Reben.
Über Pflanzenschutzmittel kann der Pilz nicht direkt bekämpft werden, daher müssen andere Lösungen gefunden werden, um dem Hopfenbau in Deutschland mit der Verticillium-Welkeproblematik zu helfen.

Bedeutung für den Hopfenbau

Früher: 1952-2005
Im deutschen Hopfenbau ist die Verticilliumwelke erstmalig seit Anfang der 1950er Jahre in seiner milden Form aufgetreten. Damals beschränkte sich der Anbau in der Hallertau auf die anfällige Landsorte Hallertauer Mittelfrüher. Bis 1964 waren ca. 3500 ha von dieser Welkekrankheit betroffen. Durch Reduzierung des Düngeniveaus auf befallenen Flächen sowie durch den Anbau der welketoleranten englischen Sorte Northern Brewer bzw. durch Züchtung von toleranteren Sorten wie Perle waren die Auswirkungen der Verticilliumwelke im Anbaugebiet durch entsprechende vorbeugende phytosanitäre und pflanzenbauliche Maßnahmen beherrschbar.
Heute:
Seit 2005 zeigen selbst früher als welketolerant eingestufte Hopfensorten wie Northern Brewer, Perle und Saphir massive Welkeschäden. Das gesamt Sortenspektrum der Hallertau kann befallen werden. Durch phytopathologische und molekulare Untersuchungen wurden aggressivere Welkepilze als Ursache nachgewiesen.

Biologie des Welkepilzes und Infektion des Hopfens

Verticillium nonalfalfae ist ein Bodenpilz, der beim Hopfen die Welkekrankheit verursacht. Der Pilz ist in lebenden und verrottenden Blättern, Reben und Wurzeln des Hopfens zu finden, ebenso im Boden. Konidien, Pilzgeflechte (Myzelien) und die dunkel gefärbten Überdauerungsmyzelien sind die infektiösen Strukturen. Über sie erfolgt auch die Weiterverbreitung. Während Konidien und Myzelien nur 2-4 Wochen überleben, bleibt das Infektionspotenzial des Dauermyzels bis zu 5 Jahre erhalten. Damit stellen Verticillium-infizierte Hopfen und ebenso abgestorbene Pflanzenteile wie auch verseuchte Böden über lange Zeit eine Infektionsgefahr dar.

Der Pilz dringt über die Wurzel ein und wächst bis in die Leitungsbahnen (Xylem) des Hopfens weiter. Dort werden auch Konidien gebildet, die einen schnellen Weitertransport des Pilzes über die wasserleitenden Gefäße bis in die oberen Teile der Rebe und in die Blätter ermöglichen. Die Konidien wachsen zu Pilzgeflechten aus und verstopfen so die Wasserleitungsbahnen der Pflanze. Bei trocken-heißer Witterung treten nachfolgend oftmals Welkesymptome an der Hopfenpflanze auf, zum Teil sterben die Reben auch ab.

Hopfengarten mit massiven Welkeschäden

Bei Verticillium infizierten Hopfen werden vielfach gescheckte Blätter gefunden. Reben zeigen oftmals braungefärbte Wasserleitungsbahnen.

Symptome:

  • Vergilben und Blattnekrosen von unten nach oben
  • Blattränder krümmen sich nach oben
  • abgestorbene Blätter fallen durch leichtes Antippen ab
  • Braunverfärbung der Leitungsbahnen (Xylem) ringförmig oder komplett
Unterscheidung von milder und letaler Verticillium-Form Milde Form:
(in Deutschland seit Anfang der 1950er-Jahre)
  • Welkesymptome ab dem 3. oder 4. Infektionsjahr
  • Einfluss von Witterung und Stickstoffdüngung
  • häufig nur eine Rebe einer Aufleitung befallen
  • mögliche Verdickung der Rebenbasis
  • kein Absterben des Stockes
Aggressive (letale) Form:
(in Deutschland seit 2005)
  • Welkesymptome treten bereits im 2. Infektionsjahr auf
  • keine Verbesserung durch reduzierte Stickstoffgaben
  • alle Triebe sind betroffen
  • Stock erholt sich nicht und stirbt meistens ab
  • befällt gesamtes Sortenspektrum der Hallertau, auch bisher als Welke-tolerant eingestufte Sorten wie Perle, Spalter Select, Saphir, Northern Brewer und Hallertauer Magnum

Vorbeugende Bekämpfungsmaßnahmen

Es ist entscheidend, frühzeitig den Verticillium-Befall zu erkennen, um eine Verbreitung in und zwischen Hopfengärten gezielt zu vermeiden oder im besten Fall einen geringen Befall zu kurieren.
Phytosanitäre und pflanzenbauliche Maßnahmen:
  • Vermeiden von Bodenverdichtungen
  • Kein Ausbringen von frischem Rebenhäcksel
  • Kein infiziertes Fechsermaterial verwenden; gesundes Pflanzmaterial mit Pflanzenpass verwenden
  • Anbau von neutralen Zwischenfrüchten (Gräser: Roggen etc.)
  • Erst gesunde, dann befallene Hopfengärten bearbeiten
  • Arbeitsgeräte sorgfältig reinigen/ desinfizieren
Zusätzliche Maßnahmen bei Neubefall oder bei Verdacht auf letale Welkeform:
(Nulltoleranzstrategie)
  • Rodung von Einzelstöcken/Nestern/Teilflächen (so früh wie möglich)
  • Entfernen und Verbrennen der gesamten Pflanze (Wurzel, Rebe, Blätter)
  • Quarantänefruchtfolge bzw. Dauerbegrünung mindestens 4-5 Jahre lang einhalten
Um mehr Erfahrung bei der Bekämpfung von Verticillium zu sammeln, wird eng mit der Praxis zusammengearbeitet. Dabei werden Landwirte bei der Anwendung der Bekämpfungsmaßnahmen beraten und unterstützt und das Ergebnis evaluiert.

Feldselektion auf Verticillium-Toleranz von Zuchtmaterial und Sorten

Zielsetzung und Maßnahmen
Ein wesentliches Ziel ist es, die Züchtung von Verticillium-toleranten Hopfensorten voranzutreiben. Um Zuchtstämme zu erkennen, die gegenüber milden und in besonderem Maße gegenüber sehr aggressiven Verticillium-Stämmen Toleranz/ Resistenz aufweisen, wurde seit 2015 auf einem Welkestandort mit der Feldtestung begonnen. In zwei ehemaligen Praxisgärten, die mit aggressiven Verticillium-Stämmen verseucht sind, werden Hüller Zuchtstämme und Sorten geprüft. Die englische Sorte Wye Target dient hierbei als welketolerante Referenzsorte und Northern Brewer als Sorte, die sich nur gegenüber der milden Welkeform als tolerant zeigt und hier auf diesen Standorten deutliche Welkesymptome erkennen lässt.
Erste Ergebnisse
Die ersten Erkenntnisse bei dieser Feld¬selektion sind vielversprechend. So wurde beispielsweise die 2016 neu auf den Markt gekommene Spezialaromasorte Ariana über dieses Feldselektionssystem geprüft und als deutlich toleranter gegenüber dem Verticilliumpilz erkannt. Aufbauend auf den Erkenntnissen dieser Feldprüfungen soll ein gezieltes Züchtungsprogramm folgen.

Bodensanierung

Im Rahmen des Projekts Forschung zur Verticilliumwelke sollen praxistaugliche Methoden zur Sanierung von mit Verticillium befallen Hopfengärten erprobt und weiterentwickelt werden.

Projektziele:

  • Evaluierung von verschiedenen Sanierungsmethoden
  • Adaptation an den Hopfenbau

Vorgehensweise:

  • Feststellung des Ausgangsbefalls anhand der Symptomatik
  • Roden des infizierten Bestandes
  • Durchführung der Sanierungsmaßnahmen:
    • Stilllegung
    • Ackerbau (Fruchtfolge mit hohem Gräseranteil)
    • Anbau von Nicht-Wirtspflanzen (Gräser)
    • Biologische Bodenentseuchung: (Einarbeiten der Biomasse/Luftabschluss durch Abdecken des Bodens)
  • Nullkontrolle:
    • Anbau des infizierten Bestandes als Nullkontrolle bis die Maßnahmen auf der Sanierungsfläche abgeschlossen sind
    • Roden des infizierten Bestandes
  • Anbau einer toleranten Sorte
  • Bewertungshorizont: mindestens 2 Jahre

Hinweise für Hopfenpflanzer

Die LfL bietet in den nächsten Monaten Workshops mit Hopfenpflanzern an, die sich mit der Verticillium-Welkeproblematik eingehend beschäftigen. Dabei steht der Erfahrungsaustausch im Mittelpunkt.

Kontakt: Simon Euringer

Tel.: 08442 9257-35
E-Mail: simon.euringer@lfl.bayern.de

Untersuchung von Praxisproben auf Verticillium im Pilzdiagnostiklabor der LfL
Welke-verdächtige Hopfen können im Pilzdiagnose-Labor der LfL in begrenzter Zahl auf Verticilliumbefall untersucht werden. Kosten der Untersuchung 49,50 €.

Anmeldung von Proben und Probenbegleitschein:
E-Mail: mykologie@LfL.bayern.de
Internet: http://www.lfl.bayern.de/ips/gartenbau/104767/index.php Externer Link

Details zur Probennahme
Zum Nachweis von Verticillium und anderer pathogener Pilze wird ein sogenannter Wachstumstest durchgeführt. Bei diesem Nachweis ist der Zustand des Probenmaterials ausschlaggebend. Um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, muss bei der Probennahme auf folgende Punkte geachtet werden.
Die Probennahme sollte nicht vor dem Auftreten der optisch festzustellenden Welkesymptome durchgeführt werden. Zeitraum: Juni – September
Die Auswahl der Pflanzen und der Probe ist der wichtigste Schritt beim Nachweis von Verticillium. Die beprobte Pflanze darf noch nicht abgestorben sein, da andere Pilze, Bakterien und andere Rottevorgänge den Nachweis erschweren oder das Ergebnis negativ beeinflussen können. Die optimale Ausgangspflanze hat bereits Symptome entwickelt, ist aber noch überwiegend lebensfähig. Die Rebe oberhalb des Bifangs stellt das beste Ausgangsmaterial dar. Die Rebenstücke (10 – 20 cm) werden in eine saubere Plastiktüte verpackt und verschlossen. Es muss auf möglichst geringen Erdanhang geachtet werden. Der Wurzelstock ist für den Nachweis von Verticillium in der Praxis nicht geeignet.
Die optimale Probennahme erleichtert die Arbeit im Labor immens. Bei Verunreinigungen durch Erde oder Fäulnisvorgängen kann der Verticilliumpilz überwachsen werden und Sie erhalten eine falsch negatives Ergebnis.
Beschriften Sie die Tüte mit der Probe mit den notwendigen Informationen (z.B. Sorte, Flurstück) und geben Sie mit der Probe einen sog. Probenbegleitschein ab, der Ihre Daten (Adresse, Tel. etc.) sowie Details zu Ihrer zu untersuchenden Probe enthält.

Probenbegleitschein Externer Link

Nach der Probennahme sollte das Pflanzenmaterial gekühlt werden und schnellstmöglich nach Freising gebracht oder per Post /Kurierdienst gesendet werden. Melden Sie auf jeden Fall Ihre Proben vor der Beprobung in Freising unter 08161/71-5651 an.

Forschung und Arbeiten zu Verticillum-freiem Hopfen

Zielsetzung
Neben der Umsetzung von pflanzenbaulichen und phytosanitären Maßnahmen (siehe „Grünes Heft “) ist die Verwendung von Verticillium-freiem Pflanzmaterial ein entscheidender Baustein, um eine weitere Verbreitung des Verticillium-Welkepilzes im Hopfenanbaugebiet zu verhindern. Um Verticillium-freies Pflanzgut für die LfL-eigenen Prüfungen und für den Vertragsvermehrer der Gesellschaft für Hopfenforschung (GfH) sicherzustellen, werden Hopfenreben auf den Pilz hin untersucht. Eine hoch empfindliche Nachweismethode wurde dazu in unserem Labor erarbeitet und etabliert, um wirklich eine zuverlässige Aussage zu bekommen, ob die Pflanze mit Verticillium infiziert ist oder frei:

Weitere Hinweise im "Grünen Heft"

Molekularer Nachweis direkt aus der Rebe über Realtime-PCR (Polymerasekettenreaktion) nach Maurer, Radišek, Berg und Seefelder (2013)
Von der zu untersuchenden Hopfenrebe wird ein Markstück, das auch die wasserleitenden Gefäße und damit möglicherweise auch Verticillium-Sporen oder –Myzel enthält, herauspräpariert. Danach wird das Rebenstück in einem Homogenisator zerkleinert und für die Isolierung der DNA verwendet; Hopfen-DNA und auch DNA von möglichen Pilzkontaminationen in den Gefäßelementen werden mit isoliert. Mit der Realtime PCR unter Einsatz der für Verticillium spezifischen Primer und –Sonden zeigt sich letztlich der Pilzbefall durch einen Fluoreszenzanstieg zwischen Vermehrungszyklus 18 bis ca. 35.

Vorteile der Realtime-PCR-Nachweismethode:

  • sehr spezifisch
  • ohne Verwechslungsgefahr mit anderen Pilzinfektionen
  • selbst geringste Pilzmengen werden erfasst
  • simultaner Nachweis von Verticillium nonalfalfae und Verticillium dahliae in einem sogenannten Multiplex-PCR-Lauf. Des Weiteren wird dabei das Funktionieren der PCR-Reaktion stets durch eine sog. interne Kontrolle sichergestellt, um „falsch negative“ Ergebnisse auszuschließen
  • Ergebnis liegt nach 2 Tagen vor

Nachteil der Realtime-PCR-Nachweismethode:

  • Nachweis beruht auf der vorhandenen DNA, die auch während des Verrottungsvorgangs noch nachweisbar sein kann. Die Realtime-PCR gibt daher keine klare Aussage, ob der Verticillium-Pilz noch infektiös wäre oder bereits abgestorben ist.
Ausblick
An einer Optimierung der Realtime-PCR wird stetig gearbeitet. Kontinuierlich wird überprüft, ob mit den in der PCR-Reaktion eingesetzten Primern zur Detektion von Verticillium nonalfalfae noch alle in der Hallertau vorkommenden milden wie auch aggressiven Rassen erfasst werden.
Phytopathologische Methode = Pilz-Wachstumstest auf Selektionsmedium
Eine andere Technik zum Nachweis von Verticillium-Befall in Hopfenreben ist der Wachstumstest. Hierbei wird aus dem Mark der Hopfenreben ein Stück herausgeschnitten und auf Pilzselektionsmedium gelegt. Nach 7-10 Tagen zeigt sich über das Pilzwachstum, ob eine Infektion mit dem Verticillium-Pilz vorliegt. Dazu wird das gewachsene Pilzmyzel unter dem Mikroskop begutachtet. Das Auftreten von wirteligen Sporenträgern des Welkepilzes – wie im kleinen Bild zu sehen - gilt als typisches Indiz für Verticillium-Befall. Bei geringem Befall besteht allerdings oftmals die Gefahr, dass das nur langsam wachsende Verticillium-Myzel von anderen Pilzen überwuchert wird und damit die Identifizierung sehr schwierig ist.

Vorteil des Pilz-Wachstumstests auf Selektionsmedium:

  • Nachweis von lebendem und infektiösem Verticillium-Pilz

Nachteile des Pilz-Wachstumstests auf Selektionsmedium:

  • Geringer Pilzbefall wird nicht erfasst, weil oftmals die langsam wachsenden Verticilliummyzelien von anderen schnell wachsenden Pilzen, die häufig im Hopfen zu finden sind, überwuchert werden
  • Verwechslungsgefahr mit anderen Pilzen
  • Erst nach 7-10 Tagen liegt das Testergebnis vor
Mit dieser Technik werden auch Hopfenproben von Praxisbeständen im Pilzdiagnostik-Labor der LfL (IPS 2b) untersucht, die von Hopfenpflanzern wegen Welkeverdachts eingeschickt wurden. Basierend auf dieser Pilzwachstumsmethode wird bei negativem Befund (= kein Wachstum von Verticillium) für Hopfenpflanzgut auch der Pflanzengesundheitspass ausgestellt.

Erzeugung von gesunden Hopfen über Meristemkultur

Verticillium, aber auch Viren können bei Hopfen zu dramatischen Ertrags- und Qualitätsausfällen führen. Doch mit Pflanzenschutzmitteln sind diese Krankheiten nicht zu bekämpfen. Umso wichtiger ist eine biotechnologische Methode, die sog. Meristemkultur, mit der es möglich ist, aus der Wachstumszone des Sprosses infizierter Hopfen nach einer
Hitzetherapie gesunde, Virus- und Verticillium-freie Pflanzen zu regenerieren.
Methode
Zur Erzeugung von Verticillium-und Virus-freien Hopfenpflanzen wird die oberste Wachstumszone (= Meristem), die sich am Ende der Sprossspitze befindet, nach einer Hitzebehandlung herauspräpariert und auf Kulturmedium zum Wachsen gebracht. Aufgrund spezieller Nährstoffe im Gewebekulturmedium entstehen aus einem Meristem bereits nach etwa 3 Wochen Blattstrukturen, die sich weiter zu einer vollständigen Pflanze entwickeln.
Zur Absicherung des virusfreien Zustandes der aus den Meristemen sich entwickelnden Hopfen werden deren Blätter mit der DASELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Technik bzw. mit der RT-PCR (Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion) von der Arbeitsgruppe IPS 2c auf die verschiedenen hopfentypischen Viren untersucht.

Zur Bestätigung der über den Meristemschritt gelungenen Eliminierung des Verticilliumpilzes werden die in vitro entstandenen Pflänzchen mit der Realtime-PCR unter Einsatz spezifischer TaqMan-Sonden und Primer auf Verticillium untersucht.
Ergebnisse zur Optimierung der Meristemkultur
Der erste Schritt bei der Entwicklung des herausgeschnittenen Meristems mit der Bildung von kleinen Blättchen verläuft relativ zügig. Aber das weitere Wachstum und die Regeneration eines vollständigen Sprosses ist ein sehr zeitaufwändiger Prozess von bis zu 10 Monaten. Insbesondere weil die regenerierten Pflänzchen am Schluss nochmals verklont werden müssen, um genügend Ausgangsmaterial für die abschließenden Analysen zu haben, wobei ihr Verticillium- und Virus-freier Status verifiziert werden soll.
Um den gesamten Prozess deutlich zu beschleunigen, wurden verschiedene Parameter zur Kulturführung erforscht und optimiert. Insbesondere durch den Einsatz des sog. RITA®-Flüssigkultursystems wurde die Regeneration der Pflänzchen im Vergleich zur Kultivierung ausschließlich auf mit Agar verfestigtem Kulturmedium gravierend verkürzt. Es entstanden vitalere Pflanzen aus der Meristemkultur und zugleich konnte die Genotypen-Abhängigkeit der Regenerationsfähigkeit deutlich verbessert werden.
Bei der Weiterkultivierung der aus den Meristemen entstandenen Blättchen ausschließlich auf Festmedium bzw. in Flüssigkultur, dem RITA-Flüssigkultursystem zeigen sich 15-Wochen nach der Meristempräparation deutliche Unterschiede. Der Flüssigkulturschritt führt zur schnelleren Regeneration von vitaleren Pflänzchen. Die aus den Meristemen regenerierten Hopfenpflänzchen werden vermehrt (verklont) und abschließend auf Viren bzw. Verticillium untersucht. Nur pathogenfreie Pflänzchen werden in Erde verpflanzt und stehen schließlich als gesundes Pflanzmaterial zur Verfügung.
Projektinformation
Projektleitung: Dr. E. Seigner und A. Lutz
Projektbearbeitung: B. Haugg
Kooperation: S. Euringer, Hochschule Weihenstephan-Triesdorf / TUM (Februar – April 2016)
P. Hager und R. Enders, IPZ 5c, Molekulare Verticilliumnachweis
Dr. L. Seigner und Team IPS 2c, Virologie , Institut für Pflanzenschutz
Förderung: Wissenschaftliche Station für Brauerei in München e.V. (2015-2017)
Förderkennzeichen: 31/590
Projektinformation
Projektleitung: N.N., Dr. E. Seigner, A. Lutz, S. Fuß, S. Euringer
Projektbearbeitung:
AG Pflanzenschutz im Hopfenbau: S. Euringer
AG Züchtungsforschung Hopfen: A. Lutz, J. Kneidl und Team,
AG Hopfenbau und Produktionstechnik: S. Fuß
Kooperation:
Institut für Pflanzenschutz, Mykologie: Dr. P. Büttner, IPS 2b
Dr. S. Radišek, Slovenian Institute of Hop Research and Brewing, Slowenien

Laufzeit: 01.06.2017 - 31.05.2020
Förderung: Gesellschaft für Hopfenforschung e.V., Erzeugermeinschaft Hopfen HVG e.G.
Förderkennzeichen: 31/599
Projektinformation
Projektleitung: Dr. E. Seigner (seit Nov. 2015); Dr. S. Seefelder (bis Okt. 2015);
Projektbearbeitung: A. Lutz, P. Hager, R. Enders, J. Kneidl und Team, Kooperationspartner: Dr. B. Büttner, IPZ 1b; Dr. L. Seigner, IPS 2c; Dr. P. Büttner, IPS 2b; Dr. S. Radišek, Slovenian Institute of Hop Research and Brewing, Slowenien
Laufzeit: seit 2008 - 31.05.2020
Förderung: Erzeugergemeinschaft Hopfen HVG e.G
Förderkennzeichen: 31/575