Forschungs- und Innovationsprojekt
Hochsensitive und hochspezifische Methoden zum sicheren Nachweis von Pflanzenviren und –viroiden

Neue Schaderreger an Pflanzen und pflanzlichen Produkten, die im Zuge des Klimawandels und der Globalisierung über Warenströme die EU und Deutschland erreichen, können erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen. Um einen Schaderreger gezielt zu bekämpfen, muss er zunächst zweifelsfrei erkannt und identifiziert werden. Dies gilt auch für Erreger, die schon lange bei uns bekannt sind. Grundvoraussetzung sind spezifische, empfindliche und zuverlässige Nachweismethoden, die jedoch nicht in jedem Fall zur Verfügung stehen. Im Rahmen eines vom Bayerischen Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten geförderten Projekts sollen wichtige diagnostische Lücken geschlossen werden.

Diagnose - eine wesentliche Komponente des umweltfreundlichen Pflanzenbaus

Die gezielte Schaderregerbekämpfung ist wesentlicher Bestandteil eines integrierten, umwelt- und ressourcenfreundlichen Pflanzenbaus zur Sicherung ausreichender Erntemengen, wirtschaftlicher Erträge und Erzeugung qualitativ hochwertiger Produkte für den Verbraucher und die verarbeitende Industrie. Eine gezielte Bekämpfung ist aber nur möglich, wenn die Schadursache zweifelsfrei geklärt ist. Grundlage für gezielte Bekämpfungsmaßnahmen sind in der Regel Labordiagnosen. Dies gilt besonders bei Virus- und Viroid-bedingten Krankheiten, die per Auge nicht oder nicht sicher feststellbar sind. Häufig sind Labordiagnosen auch per Gesetz, durch offizielle Vorgaben und Regelungen vorgeschrieben oder werden bei der Schaderregerüberwachung im Rahmen von Monitoringprogrammen durchgeführt. Amtliche Berater, Berater der Erzeugerringe, Züchter, Vermehrer, Landwirte, Gartenbauer, der Handel und die verarbeitende Industrie als unsere Kunden erwarten schnelle, verlässliche und nachvollziehbare Diagnosen und Ergebnisse. Das Spektrum an auftretenden Schaderregern nimmt kontinuierlich zu. Insbesondere als Folge der Globalisierung und des weltweiten intensiven Warenhandels sowie der Klimaveränderung werden neue Erreger eingeschleppt bzw. treten vermehrt auf. Die Erreger finden hier neue Lebensräume und können sich dann anpassen und weiter ausbreiten. Nicht immer stehen geeignete und zuverlässige Verfahren für den Nachweis der Schaderreger zur Verfügung. Auch werden die Anforderungen an eine gesicherte und schnelle Diagnose immer höher.

Akzeptanz der Untersuchungsergebnisse durch Dritte

Wesentlich bei jeglicher Diagnose ist die Akzeptanz der Untersuchungsergebnisse durch Dritte. Eine entscheidende Rolle spielt dabei die Qualitätssicherung und die Zuverlässigkeit der Diagnosemethoden und Untersuchungsergebnisse. Am Institut für Pflanzenschutz der LfL spielt deshalb das Qualitätsmanagement eine vorrangige Rolle.

Qualitätsmanagement und Akkreditierung in den Diagnoselaboren des Instituts für Pflanzenschutz

Besonders wichtig ist Qualitätssicherung, wenn Ergebnisse auch vor Gericht bestand haben müssen. Dies kann beispielsweise der Fall sein, wenn es um Quarantäneschaderreger geht. Voraussetzung für die Akzeptanz und Justiziabilität der Ergebnisse ist die Anwendung validierter Nachweisverfahren, die nach der international geltenden Norm DIN EN ISO 17025 durch die Deutsche Akkreditierungsstelle DAkkS akkreditiert sind. Validierte Nachweisverfahren sind umfassend geprüft zum Beispiel hinsichtlich ihrer Zuverlässigkeit, ihrer Spezifität und Empfindlichkeit, ihrer Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit. Die Akkreditierung wird verpflichtend für die Diagnoselabore durch die Neufassung des EU-Regelungssystems im Bereich Pflanzengesundheit und die Novellierung der bisherigen „VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 29. April 2004 über amtliche Kontrollen zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen über Tiergesundheit und Tierschutz“. Die Umsetzung der novellierten Verordnung muss innerhalb von 5 Jahren erfolgen (voraussichtlich bis zum Jahr 2018). Alle neu etablierten, aber auch alle bereits vorhandenen und routinemäßig in der Pflanzengesundheit eingesetzten Diagnoseverfahren müssen dann umfänglich validiert sein.

Ziele des Projekts

Im Rahmen des Projekts werden Diagnosemöglichkeiten und Nachweisverfahren ausgebaut, verbessert, zuverlässiger gemacht und validiert. Als Ziele sind im Einzelnen zu nennen:

  • Etablierung neuer, hochspezifischer, hochsensitiver und schneller molekularbiologischer Nachweisverfahren für ausgewählte bekannte und neue Erreger, insbesondere für Erreger, für die keine alternativen Methoden verfügbar sind oder deren Nachweis mit alternativen Methoden zu zeitaufwändig ist.
  • Prüfung und Validierung neuer wie auch vorhandener Nachweisverfahren.
  • Vorbereitung der Akkreditierung und Akkreditierung von Nachweisverfahren, insbesondere für Quarantäneschaderreger - vor dem Hintergrund der Neufassung EG-Verordnung Nr. 882/2004
Der Schwerpunkt liegt dabei folgenden Pathogenen:
  • Kartoffelspindelknollen-Viroid (Potato spindle tuber viroid) und Pospiviroide
  • Hop stunt viroid und Citrus bark cracking viroid (= Citrus viroid IV) an Hopfen
  • Pepinomosaik-Virus (Pepino mosaic virus)
  • Tabakrattle-Virus (Tobacco rattle virus)
  • Carlaviren beim Hopfen - gruppenspezifischer Nachweis
  • Gelbverzwergungsviren (Luteoviren) bei Getreide - gruppenspezifischer Nachweis
  • Petunia vein clearing pararetrovirus an Petunien und Calibrachoen
  • Blackcurrant reversion nepovirus an Johannisbeere
  • Little cherry virus 1 und Little cherry virus 2 an Kirsche

Methode

Als Methoden kommen zum Einsatz
  • ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
  • RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion)
  • Realtime RT-PCR
Die EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) hat mit dem EPPO-Standard „PM 7/98 Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity” einen umfassenden, für alle Diagnoselabore verbindlichen Standard auf den Weg gebracht, der detailliert die äußerst umfangreichen, zeit- und arbeitsintensiven Maßnahmen zur Validierung und Verifizierung von Nachweismethoden festlegt.

EPPO-Standard PM 7/98(2) zur Akkreditierung: Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity Externer Link

Der Standard ist mittlerweile auch von der DAkkS (Deutsche Akkreditierungsstelle) als verbindliches Dokument 71 SD 4 029 "Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben" übernommen worden. Basierend auf diesen offiziellen einschlägigen Vorgaben werden die entwickelten bzw. etablierten und auch bereits vorhandene Methoden umfassend validiert und deren Zuverlässigkeit geprüft. Im Vordergrund stehen dabei die Verfahrenskenngrößen
  • Sensitivität
  • Spezifität
  • Wiederholbarkeit
  • Reproduzierbarkeit
  • Robustheit

Ergebnisse

Kartoffelspindelknollen-Viroid (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) und Pospiviroide

Blätter auf einem Stück Papier

Probe von PSTVd-infizierten Tomatenblättern aus einem Versuch zur Methodenvalidierung (Foto: Marion Liebrecht)

Das konventionelle RT-PCR-Verfahren (RT-PCR = Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion) basierend auf den Primern von Verhoeven et al. (2004) und das Realtime RT-PCR-Verfahren basierend auf den Primern und der Gensonde von Boonham et al. (2004) für den Nachweis des Kartoffelspindelknollen-Viroids und die Pospiviroide in Pflanzenmaterial ist validiert und wurde Ende September 2015 erfolgreich von der DAkkS begutachtet.

Informationen zum Kartoffelspindelknollen-Viroid (PSTVd)

Geprüfte Verfahrenskenngrößen

  • Relative analytische Sensitivität: Das Realtime RT-PCR-Erfahren ist empfindlicher als das konventionelle RT-PCR-Verfahren. In der Realtime RT-PCR wurde das PSTVd zu 100 % korrekt in 1:10.000 verdünnten Pflanzenextrakten nachgewiesen. In der konventionellen RT-PCR wurde das PSTVd zu 63 % in 1:10.000 verdünnten Pflanzenextrakten und zu 94 % in 1:100 und 1:1.000 verdünnten Pflanzenextrakten gefunden.
  • Wiederholbarkeit der RNA-Extraktion: In allen 1:10.000 verdünnten Pflanzenextrakten wurde PSTVd mit der Realtime RT-PCR-Ansätze korrekt analysiert, die Wiederholbarkeit der RNA-Extraktion beträgt demzufolge 100 %.
  • Spezifität: Die in der konventionelle RT-PCR verwendeten Primer nach Verhoeven et al. (2004) bzw. die in der Realtime RT-PCR verwendeten Primer und Gensonde nach Boonham et al (2004) detektieren nicht spezifisch das PSTVd, sondern auch andere Pospiviroide. Die Identifizierung des Viroids muss deshalb in jedem Fall durch Ermittlung der genetischen Sequenz erfolgen.
  • Reproduzierbarkeit und Robustheit: Das auf PSTVd und Pospiviroide zu untersuchenden Probenmaterial kann ohne negative Auswirkung auf die Nachweisbarkeit bei Raumtemperatur, bei ca. 8 °C und bei ca. minus 80 °C gelagert werden. Die RNA kann eingefroren und bis zu 3 Mal aufgetaut werden ohne Auswirkung auf die Nachweisbarkeit, ein häufigeres Auftauen wurde nicht untersucht.
  • Selektivität: Die Selektivität wurde an unterschiedlichen Pflanzengattungen bzw. Arten (Tabak, Tomate, Calibrachoa sp., Solanum jasminoides) bewertet. Hemmende Einflüsse der Pflanzenmatrix auf den Nachweis wurden nicht festgestellt.

Pepinomosaik-Virus (Pepino mosaic virus, PepMV)

Blätter mit hellen FleckenZoombild vorhanden

Chlorosen an Tomatenblättern verursacht durch das Pepinomosaik-Virus

Das Realtime RT-PCR-Verfahren basierend auf den Primern und der Gensonde von Ling et al. (2007) für den Nachweis des Pepinomosaik-Virus in Pflanzenmaterial ist validiert und wird bei der nächsten Begutachtung durch die DAkkS zur Akkreditierung vorgeschlagen.

Informationen zum Pepinomosaik-Virus

Geprüfte Verfahrenskenngrößen

  • Relative analytische Sensitivität: PepMV ist in 1:10.000 bis 1:100.000 verdünnten Pflanzenextrakten zu 100 % nachweisbar.
  • Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der RNA-Extraktion und der Realtime RT-PCR: In allen 1:10.000 verdünnten Pflanzenextrakten wurde PepMV korrekt nachgewiesen, die Wiederholbarkeit der RNA-Extraktion beträgt demzufolge 100 %.
  • Spezifität: die PepMV-isolate der DSMZ PV-0973, PV-0974, PV-0975 wurden sicher nachgewiesen. Das DSMZ-Isolats PV-1125 war schlechter nachweisbar. Nicht alle PepMV-Isolate werden zuverlässig erfasst.

Tabakrattle-Virus (Tobacco rattle virus, TRV)

Kartoffelpflanzen mit Befall

Befall mit Tabakrattle-Virus an Kartoffelpflanzen (Foto: Gerda Bauch)

Für den Nachweis des Tabak rattle virus (Tobakrattle-Virus, TRV) wurde ein Realtime RT-PCR-Verfahren etabliert, welches einen schnellen und zuverlässigen Nachweis ermöglicht. Dabei werden die Primer und Gensonde von Mumford et al. (2000) verwendet. Zur Ergebnisüberprüfung wird anschließend eine konventionelle RT-PCR unter Verwendung der Primer von Xu & Nie (2006) durchgeführt. Beide molekularbiologischen Nachweisverfahren für TRV wurden umfänglich validiert. Zudem wurde ein Plasmidstandard zur quantitativen Bestimmung des TRV erarbeitet.
Mit dem Plasmidstandard werden definierte Konzentrationen von TRV mittels quantitativer Realtime RT-PCR nachgewiesen.Zoombild vorhanden

Mit dem Plasmidstandard werden definierte Konzentrationen von TRV mittels quantitativer Realtime RT-PCR nachgewiesen. Je niedriger der Cq-Wert, desto höher die Viruskonzentration.

Absolute analytische Sensitivität
Mit dem neu entwickelten Plasmidstandard wurde die absolute analytische Sensitivität der Realtime RT-PCR ermittelt: 30 Kopien des TRV können in einem PCR-Ansatz sicher und zu 100 % reproduzierbar nachgewiesen werden.

Weitere geprüfte Verfahrenskenngrößen

  • Relative analytische Sensitivität der Realtime RT-PCR: TRV ist in Probenverdünnungen von bis zu 1:100.000 in Wasser oder nicht infiziertem Pflanzensaft sicher und reproduzierbar nachweisbar.
  • Relative analytische Sensitivität der RT-PCR: TRV ist in Probenverdünnungen von bis zu 1:100.000 in Wasser oder nicht infiziertem Pflanzensaft zu 98 % nachweisbar. Die relative analytische Sensitivität der RT-PCR liegt geringfügig unter derjenigen der Realtime RT-PCR.
  • Die Wiederholbarkeit der RT-PCR und Realtime RT-PCR beträgt 100%.
  • Selektivität (= Einfluss der zu untersuchenden Pflanze auf das Untersuchungsergebnis): TRV ist mit Realtime RT-PCR und RT-PCR in verschiedenen Pflanzenarten sicher nachweisbar. Der mögliche Einfluss der zu untersuchenden Pflanze auf das Testergebnis wurde an drei TRV-Wirtspflanzen, nämlich Kartoffel, Gurke und Ziest, getestet.
Nachweis des TRV mittels quantitativer Realtime RT-PCR in Probenverdünnungen von bis zu 1:100.000. Jede Probe wurde in 4 Parallelen analysiert. In allen Parallelen war das Virus nachweisbar.Zoombild vorhanden

Nachweis des TRV mittels quantitativer Realtime RT-PCR in Probenverdünnungen von bis zu 1:100.000. Jede Probe wurde in 4 Parallelen analysiert. In allen Parallelen war das Virus nachweisbar.

Der Nachweis des TRV funktioniert stabil und sicher auch in Proben, die nur wenige Viruspartikel enthalten. Auch in diesen Fällen ist die Wiederholbarkeit des Tests ausgezeichnet wie aus nebenstehnder Abbildung hervorgeht.
IPS 2c_Poster_DPST Halle 2016_TRV_PlasmidstandardZoombild vorhanden

Poster zur Deutschen Pflanzenschutztagung 2016 in Halle: Abschätzung der Tabak Rattle Virus-Befallshäufigkeit in Kartoffelpartien mittels Realtime RT-PCR

Plasmidstandard für quantitative Analysen
Die an der LfL etablierte Realtime RT-PCR-Methode gewährleistet einen stabilen und spezifischen TRV-Nachweis. Die gleichzeitige Verwendung eines Plasmidstandards ermöglicht die quantitative Bestimmung des TRV-Gehalts in einer Probe. Der Plasmidstandard hat die für die PCR notwendige genetische Zielsequenz des TRV integriert und dient als Vergleichsmaß zur Untersuchung der absoluten quantitativen analytischen Sensitivität. Mit Hilfe dieses Plasmidstandars ist auch ein Vergleich verschiedener Realtime RT-PCR-Läufe möglich, ein entscheidender Vorteil bei der Testung umfangreicher Probenserien und Saatgutpartien.
Projektinformation
Laufzeit: 2015-2018
Projektleitung: Dr. Luitgardis Seigner
Projektbearbeitung: Marion Liebrecht
Finanzierung: Bayerisches Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten
Förderkennzeichen: A/15/14

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