Forschungs- und Innovationsprojekt
Entwicklung von quantitativen und qualitativen Nachweismethoden für Brandkrankheiten (Tilletia spp., Ustilago nuda) bei Weizen und Gerste mittels qPCR

Zwei Schalen mit Getreidekörnern; einmal mit Steinbrandbefall, einmal ohne Befall
Die ökologischen Weizen-, Dinkel- und Gerstenbestände sind häufig von Pilzkrankheiten befallen. Beispielsweise die Brandkrankheiten können zu einem geringeren Ertrag führen sowie einer deutlich schlechteren Produktqualität bis hin zur Nichtverwendbarkeit. Insbesondere für die ökologische Saatgutvermehrung und den internationalen Saatguthandel ist somit eine zuverlässige Bestimmung der Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung.
In diesem Forschungsprojekt werden deshalb zur sicheren Bestimmung und zeitgerechten Ergebnisbereitstellung neue und effiziente Nachweismethoden der Brandkrankheiten bei Weizen und Gerste mittels quantitativer Real-Time PCR (qPCR) entwickelt und validiert.

Ziele des Projektes

Weizenbestand mit verkürzten Halmen bedingt durch ZwergsteinbrandZoombild vorhanden

Zwergsteinbrandbefall
im Bestand

Derzeit wird zur Bestimmung des Sporenbesatzes der samen- und bodenbürtigen Erreger von Steinbrand (Tilletia caries (DC) Tul. sowie Tilletia laevis Kühn syn. T. foetida (Wallr.) Liro) und Zwergsteinbrand (Tilletia controversa Kühn) in der Saatgutuntersuchung die Filtrationsmethode mit mikroskopischer Begutachtung nach ISTA (International Seed Testing Association, Working Sheet No 53) angewendet.

Für die Bestimmung der Steinbrandarten (Steinbrand und Zwergsteinbrand) ergeben sich in der Gesundheitsuntersuchung zwei Hauptprobleme:

  • die Unterscheidung der Sporen und damit die Bestimmung der verschiedenen Arten der Brandkrankheiten, insbesondere bei Mischinfektionen, ist nur mit langjähriger Erfahrung sicher möglich
  • die Ermittlung der Befallstärke (= Anzahl Sporen pro Korn) erfolgt über eine Hochrechnung, da die händische Quantifizierung sehr zeitaufwändig ist
Zum Nachweis des Gerstenflugbrandes (Ustilago nuda (Jens.) Rostr.) sind die ISTA Methoden 7-013a und 7-013b anzuwenden. Der Untersuchungsaufwand zum Nachweis des Befalls mit Gerstenflugbrand ist sehr hoch, da die Untersuchung an 2000 präparierten Gerstenembryonen durchgeführt werden muss.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Sporen des Zwergsteinbrandes Tilletia controversa

Zwergsteinbrand Tilletia controversa - Rasterelektronen-
mikroskop

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Sporen des Zwergsteinbrandes Tilletia caries

Steinbrand Tilletia caries - Rasterelektronen-
mikroskop

Petrischalen befüllt mit Weizenkörnern unterschiedlicher Befallsstärke. Von 0 über 6000 und 100000 zu extrem vielen Brandsporen pro Korn

Weizenkörner mit 0 - 6000 - 100000 - extrem vielen Brandsporen pro Korn (von oben links nach unten rechts)

Material und Methoden

Für die qualitative Bestimmung von Steinbrand und Zwergsteinbrand werden zunächst spezifische genetische Marker entwickelt. Hierfür werden geeignete Genregionen detektiert und sequenziert. Als genetische Grundlage und zur Überprüfung der Spezifität der entwickelten Marker dient die isolierte DNA zahlreicher Steinbrand und Zwergsteinbrand Isolate aus Deutschland, Österreich, der Schweiz, den USA und weiteren Herkunftsländern. Die entwickelten Marker werden gegen die gängigen und überall vorkommenden Getreidepilze auf ihre Spezifität getestet.
Für die Quantifizierung der Brandsporen wird derzeit die Probenvorbereitung an die Anwendung in der qPCR angepasst und optimiert. Weiterhin erfolgt die Auswahl und Optimierung bestehender DNA-Extraktionsprotokolle und –Kits hinsichtlich der Verwendung von sehr robustem Sporenmaterial. Der Aufschluss jeder einzelnen Brandspore ist von enormer Wichtigkeit, um ein zuverlässiges und sensitives Ergebnis zu erzielen. Für die Quantifizierung der Pilzsporen-DNA werden Standardgeraden definierter Sporenmengen zur Kalibrierung erstellt. Abschließend werden die entwickelten Methoden anhand zahlreicher Saatgutproben optimiert und validiert.
Die Bearbeitung des Projektteiles „Gerstenflugbrand“ wurde aufgrund der abweichenden Handhabung, im Vergleich zu den an den Getreidekörnern haftenden Brandsporen des Stein- und Zwergsteinbrandes in der Priorität nach hinten verschoben.
Zwei befallene Weizenähren mit Brandbutten statt Körnern

Befallene Weizenähren mit Brandbutten statt Körnern

Bei der Probenvorbereitung werden die Brandsporen in Erlenmeyerkolben mit einer Waschlösung unter Schütteln abgewaschen.

Bei der Probenvor-bereitung werden die Brandsporen in Erlenmeyerkolben mit einer Waschlösung unter Schütteln abgewaschen

Abgewaschene Sporensuspension nach Zentrifugation in Zentrifugenröhrchen vor der DNA Extraktion

Abgewaschene Sporensuspension nach Zentrifugation in Zentrifugenröhrchen vor der DNA Extraktion

Bisherige Ergebnisse

Die Überprüfung bisher publizierter Marker und Genregionen für die Unterscheidung der Steinbrandarten bestätigte deren beschriebene Funktion nicht. Derzeit erfolgen die Sequenzierung der Pilzgenome sowie die darauf aufbauende Entwicklung der artspezifischen Marker. Vorläufige Ergebnisse zeigen weiterhin eine sehr nahe Verwandtschaft der beschriebenen Tilletia Arten, geben jedoch auch Hinweise auf artspezifische Genregionen.
Ein Protokoll zur Probenvorbereitung von Saatgutproben über die DNA-Isolation hin zum Einsatz in der qPCR wurde erfolgreich entwickelt. Der lineare Zusammenhang von Sporenmenge und optischer Dichte reiner Sporensuspensionen konnte aufgezeigt werden, was die Erstellung der Standardgeraden deutlich erleichtert.
Die Überprüfung der Sensitivität der entwickelten Methodenbestandteile und letztendlich die Validierung der Methode erfolgt durch die Anwendung der artspezifischen Marker an zahlreichen Saatgutproben.

Projektinformation
Projektleitung: Dr. Berta Killermann
Projektbearbeitung: Monika Grundler
Projektlaufzeit: 01.10.2014 - 31.12.2018
Finanzierung: Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BLE, BÖLN)
Förderkennzeichen: 2812NA017

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