Forschungs- und Innovationsprojekt
Forschungs- und Innovationsprojekt zur Verticillium-Problematik bei Hopfen

Starke Welkesymptome an einer Hopfenrebe

Starke Welkesymptome an einer Hopfenrebe

Seit etwa 15 Jahren tritt in einigen Regionen der Hallertau verstärkt die Verticillium-Welke auf. Verursacht wird diese Krankheit im Hopfen vor allem durch den Bodenpilz Verticillium nonalfalfae (ehemals: Verticillium albo-atrum) und eher selten durch Verticillium dahliae.
Aufgrund dessen wurden 2008 die Forschungsarbeiten zur Welkeproblematik im Hopfen an der Landesanstalt für Landwirtschaft wieder aufgenommen. Bei diesen Arbeiten wurden neben den sogenannten milden Welkerassen von Verticillium nonalfalfae zum ersten Mal auch aggressive Rassen in der Hallertau nachgewiesen. Sie führen auch bei früher als Welke-tolerant eingestuften Hopfensorten zu deutlichen Welke-Symptomen und zum Absterben der Reben. Durch den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln kann der Pilz nicht direkt bekämpft werden, daher müssen andere Lösungen gefunden werden, um dem Hopfenbau in Deutschland mit der Welkeproblematik zu helfen.

Bedeutung für den Hopfenbau

Früher (1952-2005)
Im deutschen Hopfenbau ist die Verticillium-Welke erstmalig seit Anfang der 1950er Jahre in seiner milden Form aufgetreten. Damals beschränkte sich der Anbau in der Hallertau auf die anfällige Landsorte Hallertauer Mittelfrüher. Bis 1964 waren etwa 3500 ha von der Krankheit betroffen. Durch eine Reduzierung des Düngeniveaus, den Anbau ausländischer Sorten (v.a. Northern Brewer) und die Züchtung von toleranteren Sorten (z.B. Perle) hielten sich die Schäden in Grenzen.
Heute
Seit dem ersten Auftreten von aggressiven Verticillium-Stämmen ist wieder eine kontinuierliche Ausbreitung der Befallsfläche im Anbaugebiet Hallertau zu beobachten. Seit 2005 zeigen selbst früher als Welke-tolerant eingestufte Hopfensorten wie Northern Brewer, Perle und Saphir massive Welkeschäden. Das gesamte Sortenspektrum der Hallertau kann befallen werden. Der Erreger ist ein im Boden lebender Pilz mit einem breiten Wirtsspektrum. Dieser kann bis zu 5 Jahre im Boden in Form eines infektiösen Dauermyzels überdauern und ist nicht direkt bekämpfbar.
Auch kommt es zu einem vermehrten Auftreten der aggressiven Form, da durch den Anbau toleranterer Sorten die natürliche Selektion des Pilzes gefördert wird. Auf Praxisflächen lässt sich meist eine Mischung aus milden und aggressiven Formen finden.
Bekannte Regulierungsmaßnahmen zeigen nur noch mäßigen Erfolg, weshalb es zu zunehmenden finanziellen Einbußen für die Landwirte kommt.
Zum besseren Management des Krankheitsbefalls sollen daher im Forschungsprojekt Hygienemaßnahmen, Züchtungsanstrengungen und Sanierungskonzepte umgesetzt werden.
Neue, alternative Präventions- und Sanierungsmaßnahme zu finden, sowie die bestmögliche Umsetzung bereits bekannter Vorsorgemaßnahmen sind von zentraler Bedeutung im Kampf gegen Verticillium im Hopfenbau.
Hopfengarten mit massiven Welkeschäden

Hopfengarten mit massiven Welkeschäden

Drohnenaufnahme Hopfengarten mit massivem Welekbefall

Drohnenaufnahme Hopfengarten mit massivem Welekbefall

Biologie des Welkepilzes und Infektion des Hopfens

Ausbreitung Verticillium in HopfenpflanzeZoombild vorhanden

Ausbreitung Verticillium in Hopfenpflanze

Biologie
Verticillium nonalfalfae ist ein Bodenpilz, der beim Hopfen die Welke-Krankheit verursacht. Der Pilz ist in lebenden und verrottenden Blättern, Reben und Wurzeln des Hopfens und im Boden zu finden. Sporen (Konidien) und die dunkel gefärbten Überdauerungsorgane (Myzelien) sind infektiöse Strukturen. Über sie erfolgt auch die Weiterverbreitung. Während Konidien nur 2 bis 4 Wochen überleben, bleibt das Infektionspotenzial des Dauermyzels bis zu 5 Jahre erhalten. Der Pilz verfügt über ein breites Wirtsspektrum, weshalb er zweikeimblättrige Unkräuter und Zwischenfrüchte befallen und sich in diesen vermehren kann. Damit stellen Verticillium-infizierte Pflanzen, abgestorbene Pflanzenteile wie auch verseuchte Böden über lange Zeit eine ständige Infektionsquelle dar.
Der Pilz dringt über die Wurzel in die Pflanze ein und wächst bis in die Leitungsbahnen (Xylem) des Hopfens weiter. Dort bilden sich Sporen, die einen schnellen Weitertransport des Pilzes über die wasserleitenden Gefäße bis in die oberen Teile der Rebe und in die Blätter ermöglichen. Die Konidien wachsen zu Pilzgeflechten aus und verstopfen so die Wasserleitungsbahnen der Pflanze. Zusätzlich werden zellwandabbauende Enzyme vom Pilz und auch toxische Stoffe ausgeschieden, die in der Pflanze Alterungsprozesse auslösen.
Schadbild
Die ersten Welke-Symptome äußern sich bei trocken-heißer Witterung ab Anfang Juni durch ein Aufhellen der unteren Blätter, die im weiteren Verlauf zu Nekrosen werden. Je nach Fortschreiten des Befalls sterben immer mehr Blätter, einzelne Aufleitungen oder sogar die ganze Hopfenpflanze ab. Des Weiteren kann die Krankheit den Übergang der generativen Phase zur vegetativen Phase verhindern, wodurch Blüte und Ausdoldung gestört werden. Nicht abgestorbene Dolden weisen bräunliche Verfärbungen auf und verschlechtern so die Qualität des Ernteguts.
Schneidet man den unteren Teil einer befallenen Rebe auf, lässt sich eine Verbräunung der Leitungsbahnen feststellen. Zum Teil kommt es zu einer Verdickung der befallenen Reben an der Basis.

Symptome:

  • gescheckte Blätter, Blattnekrosen von unten nach oben
  • Blattränder krümmen sich nach oben
  • abgestorbene Blätter fallen durch leichtes Antippen ab
  • Braunverfärbung der Leitungsbahnen (Xylem) ringförmig oder komplett

Vorbeugende Bekämpfungsmaßnahmen

Es ist entscheidend, frühzeitig den Verticillium-Befall zu erkennen, um eine Verbreitung in und zwischen Hopfengärten gezielt zu vermeiden oder im besten Fall einen geringen Befall zu kurieren.
Unterscheidung von milder und letaler Verticillium-Form:

Milde Form: (in Deutschland seit Anfang der 1950er Jahre)

  • Welke-Symptome ab dem 3. oder 4. Infektionsjahr
  • großer Einfluss von Witterung und Stickstoffdüngung
  • häufig nur eine Rebe einer Aufleitung befallen
  • mögliche Verdickung der Rebenbasis
  • kein Absterben des Stockes

Aggressive (letale) Form: (in Deutschland seit 2005)

  • Welkesymptome treten bereits im 2. Infektionsjahr auf
  • keine Verbesserung durch reduzierte Stickstoffgaben
  • alle Triebe sind betroffen
  • Stock erholt sich nicht und stirbt meistens ab
  • befällt gesamtes Sortenspektrum der Hallertau, auch bisher als Welke-tolerant eingestufte Sorten

Vorbeugende Maßnahmen:

  • Bodenverdichtungen vermeiden
  • kein Ausbringen von frischem Rebenhäcksel (mind. 4 Wochen ablagern lassen mit regelmäßigem Wenden)
  • ausschließlich gesundes Pflanzmaterial mit Pflanzenpass verwenden; keine Pflanzen aus infizierten Gärten vermehren
  • angemessene Stickstoffdüngung
  • Arbeitsgeräte sorgfältig reinigen
Zusätzliche Maßnahmen bei Neubefall oder bei Verdacht auf letale Welkeform:
(Nulltoleranzstrategie)

Bei beginnendem Befall:

  • Nulltoleranz-Strategie: so früh wie möglich bekämpfen
  • vollständiges Entfernen der infizierten Pflanzen (mit Wurzelwerk!) sowie der direkten Nachbarpflanzen, auch ohne Symptome kann eine Pflanze infiziert sein
  • Befallenes pflanzliches Material verbrennen
  • Wiederaustrieb bekämpfen
  • Düngung:
    • reduzierte Stickstoffdüngung
    • Nmin-Untersuchung
    • keine stark N-haltigen organischen Dünger (Gülle)
    • kein Rebenhäcksel ausbringen
  • Anbau neutraler Zwischenfrüchte (Gräser oder Getreide), kein erneutes Anpflanzen mit Hopfen, sondern die gerodete Fläche mit einkeimblättrigen Pflanzen begrünen, um zweikeimblättrige Wirtspflanzen (Unkräuter) zu unterdrücken
  • Feldhygiene beachten:
    • erst gesunde, dann befallene Gärten bearbeiten
    • Desinfektion der Bearbeitungsgeräte (Menno Florades)
    • Rebenhäcksel-Rückführung vermeiden
    • infizierten Rebenhäcksel mindestens 4 Wochen einer ausreichend thermischen Behandlung (durchgehende Heißrotte mit Wenden des Haufens) unterziehen
    • kein Fechsermaterial aus infizierten Hopfengärten entnehmen
    • gesundes Pflanzmaterial mit Pflanzenpass verwenden

Bei stärkerem Welke-Befall:

  • Anbau Welke-toleranter Sorten
  • Sanierung, Anbaupause von mind. 3 Jahren:
    • Ansaat einer Welke-neutralen Kultur (Gräser, Getreide, Mais)
    • Unkraut bekämpfen: potentielle Welke-Wirtspflanzen
    • Wiederaustrieb bekämpfen
  • bei nesterweisem Auftreten im Hopfengarten einen Umgriff von einer Reihe links und rechts des Befallherdes und jeweils mind. 5 m in Längsrichtung roden, kein erneutes Anpflanzen mit Hopfen, sondern die gerodete Fläche mit einkeimblättrigen Pflanzen begrünen
  • keine Erzeugung und Abgabe von Fechsermaterial im/aus dem Betrieb
Bekämpfung:
Bisher sind keine direkten Bekämpfungsmaßnahmen bekannt. Zur Befallsreduzierung werden die genannten, vorbeugenden Präventionsmaßnahmen empfohlen.
Um mehr Erfahrung bei der Bekämpfung von Verticillium zu sammeln, wird eng mit der Praxis zusammengearbeitet. Dabei werden Landwirte bei der Anwendung der Bekämpfungsmaßnahmen beraten, unterstützt und das Ergebnis evaluiert.
Rodung von Verticillium-infizierten Einzelstöcken mithilfe einer Staplergabel. Im Hintergrund Entfernen des infizierten Materials

Rodung von Verticillium-infizierten Einzelstöcken mithilfe einer Staplergabel. Im Hintergrund Entfernen des infizierten Materials

mit Spindelroder gerodeter Hopfengarten; anschließend müssen die Wurzelstöcke vom Feld entfernt und dann verbrannt werden

mit Spindelroder gerodeter Hopfengarten; anschließend müssen die Wurzelstöcke vom Feld entfernt und dann verbrannt werden

Verticillium-infizierter Wurzelstock nach dem Entfernen aus dem Hopfengarten

Verticillium-infizierter Wurzelstock nach dem Entfernen aus dem Hopfengarten

Feldselektion auf Verticillium-Toleranz von Zuchtmaterial und Sorten

Zielsetzung und Maßnahme
Ein wesentliches Ziel ist es, die Züchtung von Verticillium-toleranten Hopfensorten voranzutreiben. Um Zuchtstämme zu erkennen, die gegenüber milden und in besonderem Maße gegenüber aggressiven Verticillium-Stämmen Toleranzen aufweisen, wurde seit 2015 mit der Feldtestung in sogenannten „Selektionsgärten“ begonnen. In drei ehemaligen Praxisgärten, die mit aggressiven Verticillium-Stämmen verseucht sind, werden Hüller Zuchtstämme geprüft. Die englische Sorte Wye Target dient hierbei als Welke-tolerante Referenzsorte und Spalter Select als Sorte, die sich nur gegenüber der milden Form als tolerant zeigt, auf diesen Standorten jedoch deutliche Welke-Symptome erkennen lässt.
Hopfengarten mit massivem WelekbefallZoombild vorhanden

Test von Hopfensorten und Stämmen auf Verticillium-Toleranz auf einer ehemaligen Praxisfläche mit sehr hohem Befallsdruck

Aktuelle Ergebnisse
Ab Mitte Mai werden in den Selektionsgärten regelmäßige Bonituren durchgeführt. Dabei wird jede einzelne Rebe auf die typischen Welke-Symptome hin überprüft und bewertet. Gegen Ende des Jahres kann so ein Welke-Index gebildet werden. Dieser zeigt die Welke-Toleranz der Sorte bzw. des Zuchtstamms auf dem jeweiligen Standort. Je nach Bodenart und Infektionsdruck ergeben sich dadurch unterschiedliche Welke-Toleranzen.
Die gewonnenen Ergebnisse bilden die Grundlage für weitere Forschungs- und Züchtungsarbeiten. So wurde beispielsweise die 2016 neu auf den Markt gekommene Hüller Aromasorte Ariana über dieses Feldselektionssystem geprüft und als deutlich toleranter gegenüber dem Verticillium-Pilz erkannt als bisher angebaute Sorten.
Ausschnitt der Boniturergebnisse der Sorten und Zuchtstämme aus der Saison 2019 in 2 Selektionsgärten; schwerer Boden (links) und leichter Boden (rechts); Index von 0 (kein Befall) bis 2 (stark Welke-anfällig)

Ausschnitt der Boniturergebnisse der Sorten und Zuchtstämme

Biotest mithilfe der Zeigerpflanze Aubergine

Als passende Zeigerpflanze für die Hopfenwelke konnte die Aubergine (Solanum melongena L.) identifiziert werden, da sie auch auf diesen Erreger anfällig ist. Des Weiteren eignet sie sich für ein Topfsystem im Gewächshaus und entwickelt rasch die typischen Welke-Symptome. Mithilfe der Auberginen können beispielsweise mögliche Hygienisierungsmaßnahmen auf ihre Wirksamkeit gegenüber dem Verticillium-Pilz getestet werden.
Hierfür werden beispielsweise Bodenproben oder Rebenhäckselmaterial unterschiedlich behandelt und vorgezogene Auberginen in diesen Boden bzw. in Boden mit untergemischtem Rebenhäcksel gepflanzt.
Die Pflanzen werden im Topfsystem auf ihren Welke-Befall hin beobachtet. Bonitiert werden Parameter wie die Wuchshöhe, die Vitalität sowie die Ausprägung der Welke-Symptome. Über die Entwicklung der Auberginen in den jeweiligen Varianten kann indirekt abgeleitet werden, ob sich in den Pflanztöpfen infektiöses Verticillium befindet und somit auch, ob die Hygienisierung erfolgreich war. Zusätzlich werden ausgewählte Auberginen zur Absicherung der Ergebnisse im Labor über Realtime-PCR untersucht.
Thermische Hygienisierung von Rebenhäcksel
In diesem Versuch wurde die thermische Hygienisierung von Rebenhäcksel während einer vierwöchigen Kompostierung getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass das Infektionspotential des Verticillium-Pilzes durch eine vierwöchige Lagerung mit regelmäßigem Wenden der Rebenhäcksel gesenkt werden kann. Es muss jedoch unbedingt sichergestellt werden, dass die Erntereste regelmäßig gewendet werden, um ein Hygienisieren aller Schichten zu ermöglichen. Nur durch die hohen Temperaturen, die sich im Inneren des Rebenhäcksel-Haufens entwickeln, kommt es zu einem ausreichenden Abbau bzw. einer Inaktivierung des Pilzes und somit zu einem deutlich geringeren Infektionspotentials des Rebenhäcksels.
Als Ausgangmaterial wurden aus einem Verticillium-verseuchten Hopfengarten infizierte Hopfenreben geholt und gehäckselt. Das infizierte Material wurde fein und grob gehäckselt, um den Unterschied des Infektionspotentials der verschiedenen Materialbeschaffenheiten des Rebenhäcksels beurteilen zu können. Des Weiteren wurde eine gemischte Variante, die die Bedingungen mit dem Rebenhäcksel aus einer Pflückmaschine (Praxis) simulieren soll, angelegt.
Je nach Häcksler-Modell, das in der Pflückmaschine verbaut ist, entsteht eine unterschiedliche Grobheit des Materials. Jeder Pflanzer sollte sich der Beschaffenheit seines Rebenhäcksels bewusst sein und die Hygienisierungsmaßnahmen dementsprechend anpassen.
Ein Teil des Materials wurde vier Wochen lang kompostiert und dabei regelmäßig gewendet (ähnlich der aeroben Kompostierung). Das restliche, nicht hygienisierte Material wurde während dieser vier Wochen kühl gelagert, um die Abbauprozesse durch Mikroorganismen oder sonstige Veränderungen so gering wie möglich zu halten.
Nach der vierwöchigen Lagerung wurde der Rebenhäcksel unter die Pflanzerde der Auberginen gemischt. Dabei wurden neben einer Kontroll-Variante ohne Rebenhäcksel-Zugabe sechs weitere Varianten mit je 15 Pflanzen angelegt. Diese lassen sich anhand ihres Infektionspotentials und der Material-Beschaffenheit unterscheiden:
  1. Kontrolle (ohne Rebenhäcksel-Zugabe)
  2. nicht hygienisiert, fein
  3. nicht hygienisiert, grob
  4. nicht hygienisiert, Praxis (feines + grobes Material)
  5. thermisch hygienisiert, fein
  6. thermisch hygienisiert, grob
  7. thermisch hygienisiert, Praxis
Vergleich der Rebenhäcksel-Varianten nach der Infektion mit Verticillium-infiziertem Rebenhäcksel (nicht abgelagert gegenüber 4-wöchiger Ablagerung mit regelmäßigem Wenden der Rebenhäcksel-Schichten); Auswahl von repräsentativen Pflanzen aus jeder Variante

Auberginen Vergleich Rebenhäcksel-Varianten

Die Auberginen wurden zunächst in normaler Erde vorgezogen und dann in größere Töpfe mit den oben beschriebenen Varianten gepflanzt. Um die Reaktion der Pflanzen (Wachstum, Vitalität, Ausprägung von Welke-Symptomen) zu erfassen, wurden wöchentlich Bonituren durchgeführt, wobei sich deutliche Unterschiede zeigten: alle nicht hygienisierten Varianten führten zu deutlichen Schwächungen der Pflanze bis hin zum Absterben der Auberginen, wobei der Verlauf der Welke-Krankheit bei feinem Rebenhäckselmaterial am schnellsten beobachtet wurde. Beim hygienisierten Material hingegen war die Variante nahezu identisch mit der nicht infizierten Kontrolle, die Hygienisierungsmaßnahmen scheinen hier am effektivsten zu wirken. Insgesamt jedoch zeigt die Hygienisierung mit einer Dauer von nur vier Wochen allgemein einen sehr guten Erfolg, die Pflanzen zeigten keine oder nur geringe Beeinträchtigung durch die Welke-Krankheit.
Zusammenfassung
Insgesamt lässt sich sagen, dass das Infektionspotential durch eine vierwöchige Kompostierung mit regelmäßigem Wenden des Rebenhäcksels deutlich gesenkt werden konnte. Die thermisch behandelten Varianten schnitten besser ab als die unbehandelten Varianten. Das Niveau der Kontrolle konnte nicht ganz erreicht werden. Dennoch ist eine deutliche Verbesserung der Fitness der Pflanzen zu beobachten. Dies spricht für eine längere Lagerung bzw. Überlagerung des Materials, um so beim Ausbringen des Rebenhäcksels im Hopfengarten nicht zusätzlich den Infektionsdruck zu erhöhen. Dennoch empfiehlt es sich, Rebenhäcksel aus infizierten Beständen nicht wieder in die Hopfengärten zurückzubringen, da ein gewisses Rest-Infektionspotential bestehen bleibt. Inwieweit dieses durch eine noch längere Lagerung abnehmen kann, ist nicht abzuschätzen.

Bodensanierung

Im Rahmen des Projekts Forschung zur Verticillium-Welke sollen praxistaugliche Methoden zur Sanierung von mit Verticillium befallen Hopfengärten erprobt und weiterentwickelt werden.

Projektziele:

  • Evaluierung von verschiedenen Sanierungsmethoden
  • Adaptation an den Hopfenbau

Vorgehensweise:

  • Ausgangsbefall anhand der Symptome feststellen
  • infizierten Bestand roden
  • Sanierungsmaßnahmen durchführen:
    • Stilllegung
    • Anbau von Nicht-Wirtspflanzen: Fruchtfolge mit hohem Gräser-/Getreideanteil, Anbau von einkeimblättrigen Pflanzen, Unkraut bekämpfen
    • Biologische Bodenentseuchung: proteinhaltiges Granulat einarbeiten, Boden wässern und mit spezieller Folie abdecken, Sauerstoff-Gehalt sinkt unter 3 %, Abbau des Pilzes durch anaerobe Mikroorganismen
  • Nullkontrolle:
    • Anbau des infizierten Bestandes als Nullkontrolle bis die Maßnahmen auf der Sanierungsfläche abgeschlossen sind
    • Roden des infizierten Bestandes
  • danach: Anbau einer toleranten Sorte
  • Bewertungshorizont: mindestens 3 Jahre
Gegrubberte Teilfläche einer Hopfenanlage mit Welkebefall

Gegrubberte Teilfläche einer Hopfenanlage mit Welkebefall

Anbau von einkeimblättrigen Pflanzen zur Sanierung des Hopfengartens

Anbau von einkeimblättrigen Pflanzen zur Sanierung des Hopfengartens

Ausbringung Granulat zur Biologische Bodenentseuchung

Ausbringung von seziellem Granulat zur Biologische Bodenentseuchung

Biologische Bodenentseuchung Abdeckung mit Folie

Abdeckung mit Folie für 6 bis 8 Wochen für die Biologische Bodenentseuchung

Biologische Bodenentseuchung Drohnenaufnahme Abdeckung mit Folie

Drohnenaufnahme von der Folienabdeckung zur Biologische Bodenentseuchung

Hinweise für Hopfenpflanzer

Hopfengarten mit leichtem WelkebefallZoombild vorhanden

Hopfengarten mit leichtem Welkebefall

Die LfL bietet in den Sommermonaten ein Welke-Monitoring an. Es wird unter anderem die betroffene Fläche besichtigt und mithilfe von Drohnenbildern die Befallsverteilung im Hopfengarten bewertet. Dabei steht der Erfahrungsaustausch im Mittelpunkt.

Kontakt: Kathrin Lutz

Tel.: 08442 9257-35
E-Mail: kathrin.lutz@LfL.bayern.de

Untersuchung von Praxisproben auf Verticillium
Welke-verdächtige Hopfen können im Pilzdiagnose-Labor der LfL in begrenzter Zahl auf Verticillium-Befall untersucht werden. Die Kosten der Untersuchung belaufen sich auf 49,50 € pro Probe.

Anmeldung von Proben und Probenbegleitschein:
E-Mail: mykologie@LfL.bayern.de
Internet: Anmeldung von Proben und Probenbegleitschein Externer Link

Probennahme qPCR an Hopfenrebe

Der Rebenabschnitt innerhalb des roten Rahmens zeigt den idealen Rebenabschnitt (Teil der Pflanze/Rebe, ca. 15 cm) zur Probennahme

Details zur Probennahme
Zum Nachweis von Verticillium und anderer pathogener Pilze wird ein sogenannter Wachstumstest durchgeführt. Bei diesem Nachweis ist der Zustand des Probenmaterials ausschlaggebend. Um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, muss bei der Probennahme auf folgende Punkte geachtet werden:
Die Probennahme sollte nicht vor dem Auftreten der optisch festzustellenden Welke-Symptome durchgeführt werden. Zeitraum: Juni – September
Die Auswahl der Pflanzen und der Probe ist der wichtigste Schritt beim Nachweis von Verticillium. Die beprobte Pflanze darf noch nicht abgestorben sein, da andere Pilze und Bakterien ansonsten den Nachweis erschweren oder das Ergebnis negativ beeinflussen können. Die optimale Ausgangspflanze hat bereits Symptome entwickelt, ist aber noch überwiegend lebensfähig. Die Rebe 15 cm oberhalb des Bifangs stellt das beste Ausgangsmaterial dar. Die Rebenstücke (10 – 20 cm) werden in eine saubere Plastiktüte verpackt und verschlossen. Dabei muss auf möglichst geringen Erdanhang geachtet werden. Der Wurzelstock ist für den Nachweis von Verticillium in der Praxis nicht geeignet.
Die optimale Probennahme erleichtert die Arbeit im Labor immens. Bei Verunreinigungen durch Erde oder Fäulnisvorgängen kann der Verticillium-Pilz überwachsen werden und Sie erhalten eine falsches, negatives Ergebnis.
Beschriften Sie Proben-Tüte mit den notwendigen Informationen (z.B. Name, Sorte, Datum) und geben Sie mit der Probe einen Probenbegleitschein ab, der Ihre Kontaktdaten (Adresse, Tel. etc.) sowie Details zu Ihrer zu untersuchenden Probe enthält. Dieser Probenbegleitschein kann unter folgendem Link heruntergeladen werden:

Probenbegleitschein Externer Link

Nach der Probennahme sollte das Pflanzenmaterial gekühlt werden und schnellstmöglich nach Freising gebracht oder per Post /Kurierdienst gesendet werden. Melden Sie auf jeden Fall Ihre Proben vor der Beprobung in Freising unter 08161/71-5651 an.
Laborwachstumstest auf Verticillium

Laborwachstumstest auf Verticillium

Petrischale mit weißem Pilzmyzel zur mikroskopischen Identifizierung von Verticillium

Petrischale mit weißem Pilzmyzel zur mikroskopischen Identifizierung von Verticillium

Forschung und Arbeiten zu Verticillum-freiem Hopfen

Zielsetzung
Neben der Umsetzung von pflanzenbaulichen und phytosanitären Maßnahmen (siehe „Grünes Heft “) ist die Verwendung von Verticillium-freiem Pflanzmaterial ein entscheidender Baustein, um eine weitere Verbreitung des Verticillium-Pilzes im Hopfenanbaugebiet zu verhindern. Um Verticillium-freies Pflanzgut für die LfL-eigenen Prüfungen und für den Vertragsvermehrer der Gesellschaft für Hopfenforschung (GfH) sicherzustellen, werden Hopfenreben auf den Pilz hin untersucht. Eine hoch empfindliche Nachweismethode wurde dazu in unserem Labor erarbeitet und etabliert, um wirklich eine zuverlässige Aussage zu bekommen, ob die Pflanze mit Verticillium infiziert oder frei vom Pilz ist.
Molekularer Nachweis direkt aus der Rebe über Realtime-PCR (Polymerasekettenreaktion) nach Maurer, Radišek, Berg und Seefelder (2013)
Von der zu untersuchenden Hopfenrebe wird ein Markstück, das auch die wasserleitenden Gefäße und damit möglicherweise auch Verticillium-Sporen oder –Myzel enthält, herauspräpariert. Danach wird das Rebenstück in einem Homogenisator zerkleinert und für die Isolierung der DNA verwendet; Hopfen-DNA und auch DNA von möglichen Pilzkontaminationen in den Gefäßelementen werden mit isoliert. Mit der Realtime PCR unter Einsatz der für Verticillium spezifischen Primer und –Sonden zeigt sich letztlich der Pilzbefall durch einen Fluoreszenzanstieg zwischen Vermehrungszyklus 18 bis ca. 35.
Ablauf des Verticillium-Nachweises von der Probennahme über die Homogenisierung des Rebenmaterials bis hin zum molekularen Nachweis über Realtime-PCR

Rebe-Mühle-PCR-Vert-Test

Vorteile der Realtime-PCR-Nachweismethode:

  • sehr spezifisch
  • ohne Verwechslungsgefahr mit anderen Pilzinfektionen
  • selbst geringste Pilzmengen werden erfasst
  • simultaner Nachweis von Verticillium nonalfalfae und Verticillium dahliae in einem sogenannten Multiplex-PCR-Lauf. Des Weiteren wird dabei das Funktionieren der PCR-Reaktion stets durch eine sog. interne Kontrolle sichergestellt, um „falsch negative“ Ergebnisse auszuschließen
  • Ergebnis liegt nach 2 Tagen vor

Nachteil der Realtime-PCR-Nachweismethode:

  • Nachweis beruht auf der vorhandenen DNA, die auch während des Verrottungsvorgangs noch nachweisbar sein kann. Die Realtime-PCR gibt daher keine klare Aussage, ob der Verticillium-Pilz noch infektiös wäre oder bereits abgestorben ist.
Ausblick
An einer Optimierung der Realtime-PCR wird stetig gearbeitet. Kontinuierlich wird überprüft, ob mit den in der PCR-Reaktion eingesetzten Primern zur Detektion von Verticillium nonalfalfae noch alle in der Hallertau vorkommenden milden wie auch aggressiven Rassen erfasst werden.
Phytopathologische Methode = Pilz-Wachstumstest auf Selektionsmedium
Eine andere Technik zum Nachweis von Verticillium-Befall in Hopfenreben ist der Wachstumstest. Hierbei wird aus dem Mark der Hopfenreben ein Stück herausgeschnitten und auf Pilzselektionsmedium gelegt. Nach 7-10 Tagen zeigt sich über das Pilzwachstum, ob eine Infektion mit dem Verticillium-Pilz vorliegt. Dazu wird das gewachsene Pilzmyzel unter dem Mikroskop begutachtet. Das Auftreten von wirteligen Sporenträgern des Welkepilzes – wie im kleinen Bild zu sehen - gilt als typisches Indiz für Verticillium-Befall. Bei geringem Befall besteht allerdings oftmals die Gefahr, dass das nur langsam wachsende Verticillium-Myzel von anderen Pilzen überwuchert wird und damit die Identifizierung sehr schwierig ist.

Vorteil des Pilz-Wachstumstests auf Selektionsmedium:

  • Nachweis von lebendem und infektiösem Verticillium-Pilz

Nachteile des Pilz-Wachstumstests auf Selektionsmedium:

  • Geringer Pilzbefall wird nicht erfasst, weil oftmals die langsam wachsenden Verticilliummyzelien von anderen schnell wachsenden Pilzen, die häufig im Hopfen zu finden sind, überwuchert werden
  • Verwechslungsgefahr mit anderen Pilzen
  • Erst nach 7-10 Tagen liegt das Testergebnis vor
Mit dieser Technik werden auch Hopfenproben von Praxisbeständen im Pilzdiagnostik-Labor der LfL (IPS 2b) untersucht, die von Hopfenpflanzern wegen Welkeverdachts eingeschickt wurden. Basierend auf dieser Pilzwachstumsmethode wird bei negativem Befund (= kein Wachstum von Verticillium) für Hopfenpflanzgut auch der Pflanzengesundheitspass ausgestellt.

Erzeugung von gesunden Hopfen über Meristemkultur

Verticillium, aber auch Viren können bei Hopfen zu dramatischen Ertrags- und Qualitätsausfällen führen. Doch mit Pflanzenschutzmitteln sind diese Krankheiten nicht zu bekämpfen. Umso wichtiger ist eine biotechnologische Methode, die sog. Meristemkultur, mit der es möglich ist, aus der Wachstumszone des Sprosses infizierter Hopfen nach einer Hitzetherapie gesunde, Virus- und Verticillium-freie Pflanzen zu regenerieren.
Aus der hitzebehandelten Sprossspitze wird das Meristem herauspräpariert; auf Kulturmedium entwickelt sich daraus ein Hopfenpflänzchen.
Methode
Zur Erzeugung von Verticillium-und Virus-freien Hopfenpflanzen wird die oberste Wachstumszone (= Meristem), die sich am Ende der Sprossspitze befindet, nach einer Hitzebehandlung herauspräpariert und auf Kulturmedium zum Wachsen gebracht. Aufgrund spezieller Nährstoffe im Gewebekulturmedium entstehen aus einem Meristem bereits nach etwa 3 Wochen Blattstrukturen, die sich weiter zu einer vollständigen Pflanze entwickeln.
Zur Absicherung des virusfreien Zustandes der aus den Meristemen sich entwickelnden Hopfen werden deren Blätter mit der DASELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Technik bzw. mit der RT-PCR (Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion) von der Arbeitsgruppe IPS 2c auf die verschiedenen hopfentypischen Viren untersucht.
Zur Bestätigung der über den Meristemschritt gelungenen Eliminierung des Verticillium-Pilzes werden die in vitro entstandenen Pflänzchen mit der Realtime-PCR unter Einsatz spezifischer TaqMan-Sonden und Primer auf Verticillium untersucht.
Regeneration des Meristems in vollständige Hopfenpflänzchen in Flüssigkultur bzw. auf Festmedium. Deutlich schnellere Entwicklung von schönen, vitalen Hopfen durch den Flüssigkulturschritt.
Aus der hitzebehandelten Sprossspitze wird das Meristem herauspräpariert; auf Kulturmedium entwickelt sich daraus ein Hopfenpflänzchen

Aus der hitzebehandelten Sprossspitze wird das Meristem herauspräpariert

Ergebnisse zur Optimierung der Meristemkultur
Der erste Schritt bei der Entwicklung des herausgeschnittenen Meristems mit der Bildung von kleinen Blättchen verläuft relativ zügig. Aber das weitere Wachstum und die Regeneration eines vollständigen Sprosses ist ein sehr zeitaufwändiger Prozess von bis zu 10 Monaten. Insbesondere weil die regenerierten Pflänzchen am Schluss nochmals verklont werden müssen, um genügend Ausgangsmaterial für die abschließenden Analysen zu haben, wobei ihr Verticillium- und Virus-freier Status verifiziert werden soll.
Um den gesamten Prozess deutlich zu beschleunigen, wurden verschiedene Parameter zur Kulturführung erforscht und optimiert. Insbesondere durch den Einsatz des sog. RITA®-Flüssigkultursystems wurde die Regeneration der Pflänzchen im Vergleich zur Kultivierung ausschließlich auf mit Agar verfestigtem Kulturmedium gravierend verkürzt. Es entstanden vitalere Pflanzen aus der Meristemkultur und zugleich konnte die Genotypen-Abhängigkeit der Regenerationsfähigkeit deutlich verbessert werden.
Bei der Weiterkultivierung der aus den Meristemen entstandenen Blättchen ausschließlich auf Festmedium bzw. in Flüssigkultur, dem RITA-Flüssigkultursystem zeigen sich 15-Wochen nach der Meristempräparation deutliche Unterschiede. Der Flüssigkulturschritt führt zur schnelleren Regeneration von vitaleren Pflänzchen. Die aus den Meristemen regenerierten Hopfenpflänzchen werden vermehrt (verklont) und abschließend auf Viren bzw. Verticillium untersucht. Nur pathogenfreie Pflänzchen werden in Erde verpflanzt und stehen schließlich als gesundes Pflanzmaterial zur Verfügung.
Regeneration des Meristems in vollständige Hopfenpfänzchen in Flüssigkultur bzw. auf Festmedium. Deutlich schnellere Entwicklung von schönen, vitalen Hopfen durch den Flüssigkulturschritt

Regeneration des Meristems in vollständige Hopfenpfänzchen in Flüssigkultur

Projektinformation
Projektleitung: S. Euringer
Projektbearbeitung: K. Lutz und Team IPZ 5b
Kooperation:
Erzeugergemeinschaft Hopfen HVG e.G. (Selektionsgärten, Biologische Bodenentseuchung)
AG Züchtungsforschung Hopfen: Dr. E. Seigner, A. Lutz, P. Hager, R. Enders, J. Kneidl und Team
AG Hopfenbau und Produktionstechnik: S. Fuß, A. Schlagenhaufer
Institut für Pflanzenschutz, Mykologie: Dr. P. Büttner
Slovenian Institute of Hop Research and Brewing: Dr. S. Radišek
Laufzeit: 01.06.2017 – 29.10.2023
Förderung: Gesellschaft für Hopfenforschung e.V.
Förderkennzeichen: 31/599
Projektinformation
Projektleitung: Dr. E. Seigner und A. Lutz
Projektbearbeitung: B. Haugg
Kooperation:
S. Euringer, Hochschule Weihenstephan-Triesdorf / TUM (Februar – April 2016)
AG Züchtungsforschung Hopfen: P. Hager und R. Enders
Institut für Pflanzenschutz, Virologie: Dr. L. Seigner und Team
Förderung: Wissenschaftliche Station für Brauerei in München e.V. (2015 – 2017)
Förderkennzeichen: 31/590
Projektinformation
Projektleitung: Dr. E. Seigner (seit Nov. 2015); Dr. S. Seefelder (bis Okt. 2015)
Projektbearbeitung: A. Lutz, P. Hager, R. Enders, J. Kneidl und Team
Kooperationspartner:
Institut für Pflanzenschutz, Virologie: Dr. L. Seigner
Slovenian Institute of Hop Research and Brewing: Dr. S. Radišek
Laufzeit: seit 2008 – 31.01.2021
Förderung: Erzeugergemeinschaft Hopfen HVG e.G.
Förderkennzeichen: 31/575