Forschungs- und Innovationsprojekt
Digi-Test: Neue Direktnachweise für Kartoffelviren und -bakterien

Kartoffelknollen in einer Kiste

Entwicklung einer multiplexen digitalen DiRT-PCR für die Kartoffelknollentestung auf Viren und Pathogene der Schwarzbeinigkeit und bakteriellen Welke aus demselben Probenmaterial

Gesundes Kartoffelsaatgut ist essentiell für eine langfristige Versorgung der Bevölkerung mit Kartoffeln in hoher Qualität. Es ist daher wichtig, relativ früh und zuverlässig den Krankheitsbesatz festzustellen. Im Projekt Digi-Test untersuchen wir, wie Kartoffelproben aus dem Feld direkt, sensitiv und zeitsparend im Labor auf viele Viren und Bakterien gleichzeitig getestet werden können.
Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines hochmodernen nucleinsäurebasierten Testverfahrens, das mehrere Viren und Bakterien direkt auf dem verdünnten Saft der Kartoffelknolle nachweist. Dieses kann bisherige, zeitintensivere Standard-Verfahren ganz oder teilweise ersetzen.

Ziele

Entwicklung eines geeigneten Nachweis-Verfahrens das die folgende Anforderungen erfüllt

  • nucleinsäurebasierter Nachweis von Viren und Bakterien (real-time quantitative Polymerase Kettenreaktion)
  • direkter Nachweis aus dem Press-Saft der dormanten Kartoffelknolle (DiRT-qPCR)
  • gleichzeitiger Nachweis mehrerer Viren und Bakterien in einer Reaktion (Multiplex-DiRT-qPCR)
  • Möglichkeit der gleichzeitigen Testung mehrerer Einzelproben (Pool-Proben)

Methoden

Bedeutung und Testung der Kartoffelviren

Die Kartoffel Solanum tuberosum ist ein bedeutender ökonomischer Faktor in der konventionellen und ökologischen Landwirtschaft. Die Testung auf Krankheiten ist für den erfolgreichen Anbau von Zucht- und Vermehrungsmaterial unumgänglich. Ein Befall mit den Kartoffelviren PLRV (Potato Leaf Roll Virus) PVY, M, A, X und S (Potato Virus Y, M, A, X und S) kann bis zu 80% Ertragsminderung bedeuten (siehe Linkliste am Ende der Seite).
Der bisher etablierte, obligatorische Viren-Test vor der Pflanzgut-Ausbringung wird mit dem serologischen Verfahren ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt. Dies hat den Nachteil, dass jeder Virus einzeln und erst am Blatt getestet werden kann. Die dazu erforderlichen Arbeiten sind aufwendig, langwierig und benötigen hohe Glashauskapazitäten.
Auf Grund dessen wurden in den letzten Jahren bereits die sensitivere und schnellere Multiplex-qRT-PCR (Multiplex quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion) entwickelt, die mehrere Viren in einer Reaktion testet. Die bisher etablierten Reaktionen erfordern allerdings eine teure und zeitraubende Aufreinigung der Viren-RNA. Für ein Hochdurchsatzverfahren in der gängigen Virentestung muss deshalb nach effizienteren Möglichkeiten gesucht werden.

Phänotypische Ausprägung mit Viren infizierter Kartoffelpflanzen

Bedeutung und Testung der Schwarzbeinigkeitsbakterien auf Kartoffeln

Schwarzbeinigkeit ist neben den Quarantänebakteriosen die bedeutendste Bakterienkrankheit in Kartoffeln. Sie kann chemisch nicht bekämpft werden. Sie wird in Europa verursacht durch die Bakterien Dickeya-Arten, Pectobacterium atrosepticum und Pectobacterium carotovorum subspezies carotovorum. In den letzten Jahren wurden zwei weitere, virulente Subspezies entdeckt, die erhebliche Feld- und Lagerschäden nach sich ziehen können: Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis und Pectobacterium wasabiae.
Latenter Befall mit Schwarzbeinigkeitsbakterien ist auf dem Feld nicht zu erkennen. Bei entsprechenden Witterungs- und Lagerbedingungen können sich die Erreger vermehren und zu großen Schäden führen. Demzufolge wird der Bedarf immer höher, das Pflanzgut vor der Ausbringung auf die häufigsten und virulentesten Bakterienarten zu testen. Aktuell kann auf mehrere Bakterien gleichzeitig in der konventionellen PCR getestet werden. Jedoch sind hier wieder aufwendige DNA-Extraktionen und Elektrophorese-Gelanalysen notwendig.

Ergebnisse

Im Rahmen der Forschungsarbeiten zur Methodenentwicklung „Blue LAMP“,Virustestung Kartoffel (Johanna Stammler, TUM und Adolf Kellermann, LfL, siehe Linkliste am Ende der Seite), das von der LfL beantragt und vom StMELF gefördert war, wurden Verfahren entwickelt, die ohne den zeit- und kostenintensiven Schritt der DNA-Extraktion auskommen (DiRT-Verfahren = Direct Reverse Transkriptase Quantitative PCR). Derzeit müssen für eine hohe Nachweissicherheit noch alle Viren einzeln getestet werden. Im Rahmen dieses Projektes werden diese Tests weiterentwickelt und in ein hochdurchsatzfähiges digitales Multiplex Verfahren eingearbeitet. Dieses Verfahren wird im zweiten Schritt auch auf Schwarzbeinigkeitserreger erweitert.

Aktueller Stand und Projektplan

Bild mit schematischer Darstellung der Kartoffelknollenprobe vom Sack bis zum TestergebnisZoombild vorhanden

Schematischer Weg der Kartoffelknollenprobe vom Kartoffelsack bis um fertigen Testergebnis

Die zu testenden 100 Kartoffeln pro Probe (oben) werden zu jeweils 10 Knollen gruppiert (gepoolt). Hieraus wird der Saft gewonnen und für jede Gruppe eine multiplexe DiRT-qPCR für Bakterien (links) und eine für Viren (rechts) durchgeführt. Dabei werden spezifische DNA-Abschnitte des jeweiligen Erregers amplifiziert. Die Fluoreszenz in der Probe steigt stetig an. Ab einem Schwellenwert der auftauchenden Kurve für den jeweiligen Erreger im Diagramm gilt die Probe als befallen. Für jeden Erreger wird ein anderer Farbstoff verwendet, so kann man die Kurven im Diagramm farblich unterscheiden.
Abkürzungen für die Erreger im Diagramm: Dick=Dickeya, Pcc=Pectobacterium carotovorum carotovorum, Pba=Pectobacterium atrosepticum, PVY und PVM=Potato Virus Y und M, PLRV=Potato Leaf Roll Virus=Blattrollvirus.

Projektfortschritt und Überführung in die Routinetestung

Die real-time DiRT-PCR Multiplexentwicklung für Viren und Bakterien wurde im Sommer 2017 abgeschlossen. Alle sechs Viren und Bakterien können mit der neuen multiplexen real-time DiRT-PCR zuverlässig in zwei Reaktionen auf Knollensaft nachgewiesen werden.
Die Validierung an einzelnen Knollen für Viren, d.h. die gleichzeitige Testung zufällig ausgewählter Knollen mit der herkömmlichen ELISA-Methode mit der neuen multiplexen real-time DiRT-PCR, wurde im Herbst 2019 abgeschlossen. Sie ist mit den statistischen Indizes für gut bis sehr gut bewertet und wird in einer wissenschaftlichen Fachzeitschrift veröffentlicht.
In dieser Testsaison 2020/21 wurde die Validierung in der Pooltestung abgeschlossen. Hier wurde die multiplexe real-time DiRT-PCR mit einer Extraktions-PCR-Methode und mit ELISA verglichen. Die Übereinstimmung ist diesmal durchweg sehr gut.
Nach dieser Erfolgsserie wird die Methode in der nächsten Saison 2021/22 in die Routinetestung für Viren eingeführt.
Kartoffeln in einer Hand, die andere schneidet mit einem Messer das Nabelende aus

Ausschneiden von Nabelenden der Kartoffelknollen

Extraktionsbeutel mit gepressten Nabelenden einer Kartoffel

Gepresste Nabelenden von Kartoffelknollen in Extraktionsbeuteln

Beutel in einer Hand mit pipettiertem Kartoffelpresssaft

Heraus-Pipettieren des Kartoffelpresssaftes aus dem Beutel in Deep-Well-Platten

Mitarbeiterin am Laptop, auf dem die Ergebnisse der eingesetzten PCR-Platten angezeigt werden

Einsetzen der PCR-Platten in die real-time-PCR-Maschine und daneben Ausgabe der Daten auf dem Laptop

Fotos: Tobias Hase, StMELF

Projektinformation
Laufzeit: 01.06.2016 bis 30.11.2021
Kostenträger: Bayerisches Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten (StMELF)
Pflanzkartoffel-Fördergemeinschaft des Landesverbandes der Saatkartoffel-Erzeugervereinigungen in Bayern e.V.
Projektleitung: Gerda Bauch (IPZ6a), Adolf Kellermann (IPZ3a)
Projektbearbeitung: Dr. Mirjam Prinz (IPZ6a und 3a)
Technische Assistenz: Madlen Ludwig (IPZ6a)
Förderkennzeichen: A/18/11

Kontakt

Dr. Mirjam Prinz
Tel.: 08161 71-3636
E-Mail: Mirjam.Prinz@lfl.bayern.de