Forschungs- und Innovationsprojekt
Monitoring von Ährenfusariosen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden

Monitoring von Ährenfusariosen unter Einbeziehung molekularbiologischer Methoden zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Fusarium spp.

Ährenfusariosen sind ein weltweites Problem bei Weizen: Einerseits vermindern sie den Ertrag, andererseits kommt es durch den Befall zu einer deutlichen Verschlechterung der Weizenqualität vor allem durch die im Korn gebildeten Giftstoffe, die sog. Trichothecen-Mykotoxine.
Diese Trichothecen-Mykotoxine können das Erntegut und daraus produzierte Nahrungsmittel erheblich belasten und so eine Gefahr für den Verbraucher darstellen. Der wichtigste Vertreter dieser Toxine ist das Deoxynivalenol (DON). Zur Minimierung des Risikos wurden von der EU im Jahr 2006 Höchstwerte für Fusarientoxine in Lebensmitteln festgelegt. Dadurch erhält das Thema „Mykotoxine“ für Landwirte, Mühlen und Handel höchste Brisanz.
In den Jahren 2003 bis 2007 wurde ein vom Bayerischen Staatsministerium für Ernährung, Landwritschaft und Forsten gefördertes Projekt zur Fusarium-Problematik durchgeführt. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag auf der Entwicklung neuer, verbesserter Diagnoseverfahren.

Neue Diagnoseverfahren

Schnelle und hoch spezifische PCR-Methoden für verschiedene Fusarium-Arten

Art DatenblattZoombild vorhanden

Elektrophoresegel mit spezifischen PCR-Produkten

Für den Nachweis von Fusarien standen bis vor einigen Jahren nur relativ zeitaufwändige konventionelle Methoden, wie Mikroskopie und Plattenkultur, zur Verfügung, die nicht in jedem Fall eine sichere Diagnose erlaubten. Zur Verbesserung der Fusarium-Diagnostik wurden im vorgelegten Projekt qualitative PCR-Verfahren für den Nachweis und die zuverlässige Differenzierung von F. culmorum, F. avenaceum, F. moniliforme var. subglutinans, F. poae, F. pseudograminearum, Microdochium nivale var. majus und var. nivale erarbeitet.

Realtime-PCR-Vefahren für quantitative Analysen

Schnelle und spezifische quanitative Realtime-PCR-Verfahren wurden für F. graminearum und Trichothecen-bildende Fusarien-Arten entwickelt und für den Einsatz in der Routinediagnostik etabliert.

Analyse der Genaktivität

Des Weiteren wurde ein Realtime-RT-PCR-System für die Analyse und Quantifizierung der Aktivität (Expression) des für die Trichothecen-Mykotoxin-Bildung verantwortlichen Tri5-Gens entwickelt.
RT-PCR steht dabei für "Reverse Transkriptase-PCR"; dabei wird nicht DNA nachgewiesen, wie üblicherweise bei der PCR, sondern RNA, welche in DNA überführt wird und dann über PCR detektiert wird. Im vorliegenden Falle handelt es sich um die messenger-RNA des Tri5-Gens, die nur dann synthetisiert wird, wenn das Gen aktiv ist.

Feldversuche

Neu etablierte PCR-Verfahren für die Analyse von Freilandproben
Mit Hilfe der neuen quantitativen Realtime-PCR-Verfahren wurde im Rahmen von Feldversuchen über drei Vegetationsperioden hinweg die Entwicklung des Fusarium-Befalls nach künstlicher Inokulation an den Standorten Frankendorf und Osterseeon an unterschiedlich Fusarium-anfälligen Sorten (’Complet’ und ’Petrus’ in den Jahren 2004/2005 bzw. ’Complet’ und ’Solitär’ im Jahr 2006) verfolgt. Parallel dazu wurde die Aktivität des Tri5-Gens mittels quantitativer RT-PCR und über kompetitiven ELISA die DON-Produktion untersucht.

Ergebnisse

Als Folge der im Frühjahr durchgeführten künstlichen Inokulation kam es in allen Versuchsjahren zu einer Infektion der Weizenpflanzen, die in den Ähren über den PCRNachweis von F. graminearum- und Tri5-DNA eindeutig festgestellt wurde. Bei beiden Sorten war an beiden Standorten ein Anstieg des Befalls im Laufe der weiteren Ährenentwicklung zu beobachten, der mit einer polynomischen Funktion mehr oder weniger gut beschreibbar war. Zudem konnte stets ein deutlicher Anstieg des DON-Gehaltes in den Ähren gemessen werden, der in zeitlichem Zusammenhang mit der Befallsentwicklung stand. Die Akkumulation des Toxins geht folglich größtenteils mit dem Wachstum des Pilzes einher. Am Ende der Vegetationsperiode wurde in jedem Fall der derzeitige Höchstwert für DON in Getreide überschritten. Angaben für die Festlegung eines frühest möglichen Termins zur Prognose der DON-Belastung zur Ernte können aufgrund der vorliegenden Daten nicht gemacht werden. Grundsätzlich sind frühzeitige Prognosen, die zudem nur auf wenigen Messwerten basieren, kritisch zu betrachten. Allerdings können schon vor der Ernte gemessene hohe DON-Gehalte als „Warnsignal“ gewertet werden.
Hinsichtlich der Entwicklung von F. graminearum in der Pflanze wie auch des Verlaufs der DON-Produktion waren signifikante Unterschiede zwischen den Sorten, den Standorten und den Anbaujahren zu erkennen. Teilweise wurden dabei signifikante Wechselwirkungen zwischen Sorte und Jahr bzw. Standort und Jahr festgestellt. Unterschiede in der Aktivität des „Mycotoxin-Gens“ Tri5-Gen, die durch einen mehr oder weniger konstanten Anstieg ab Mitte Blüte/Mitte Milchreife und ein nachfolgendes Absinken auf das anfängliche Niveau charakterisiert war, bezogen auf Standort, Sorte oder Anbaujahr waren größtenteils nicht statistisch abzusichern. Eine Korrelation des Maximums der Tri5-Genexpression und des DON-Gehalts der Körner am Ende der Vegetationsperiode ließ sich nicht feststellen. Möglicherweise spielten hier methodisch bedingte Unwägbarkeiten eine Rolle. Die gewonnenen Ergebnisse weisen mehr oder weniger deutlich auf einen zeitlichen Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Fusarium-Befalls, der Aktivität der Mykotoxin-Gene und der DON-Produktion hin.
Unterschiede in der Aktivität des „Mycotoxin-Gens“ Tri5-Gen, die durch einen mehr oder weniger konstanten Anstieg ab Mitte Blüte/Mitte Milchreife und ein nachfolgendes Absinken auf das anfängliche Niveau charakterisiert war, bezogen auf Standort, Sorte oder Anbaujahr waren größtenteils nicht statistisch abzusichern. Eine Korrelation des Maximums der Tri5-Genexpression und des DON-Gehalts der Körner am Ende der Vegetationsperiode ließ sich nicht feststellen. Möglicherweise spielten hier methodisch bedingte Unwägbarkeiten eine Rolle. Die gewonnenen Ergebnisse weisen mehr oder weniger deutlich auf einen zeitlichen Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Fusarium-Befalls, der Aktivität der Mykotoxin-Gene und der DON-Produktion hin.

Fazit

Die im Rahmen des Projekts erarbeiteten und für die Anwendung in der Routine etablierten qualitativen und quantitativen PCR-Techniken stellen eine Bereicherung der Fusarium-Diagnostik an der LfL dar. Die unter natürlichen Freilandbedingungen dreijährigen, von Beginn des Ährenschiebens bis zur Ernte kontinuierlich durchgeführten epidemiologischen Untersuchungen zur Entwicklung des Fusarium-Befalls sind bislang einzigartig. Aufgrund des engen Beprobungsschlüssels war es möglich, die Entwicklung des Pilzes in den Weizenpflanzen zeitnah zu verfolgen und zeitliche Zusammenhänge zwischen Fusarium-Etablierung im Wirt, Tri5-Genaktivität und DON-Produktion zu erkennen.
Standort und Sorte wurden als wesentliche, das gesamte Befallsgeschehen beeinflussende Faktoren identifiziert. Die festgestellten Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsjahren weisen auf die Witterung als zusätzlichen Einflussfaktor hin. Die beobachteten Wechselwirkungen zwischen Standort, Sorte und Jahr verdeutlichen die Komplexität des Befallsgeschehens und zeigen klar, wie schwierig es ist, zuverlässige Prognosen für Fusarium-Befall und DON-Belastung abzugeben. Erhebliche Forschungsarbeiten sind weiterhin notwendig, bis der Praxis ein zuverlässiges Prognosemodelle zur Verfügung gestellt werden kann. Die in dem Projekt erarbeiteten Daten leisten hierfür einen wesentlichen Beitrag.
Projektinformation
Projektleitung: Dr. Luitgardis Seigner
Projektbearbeitung: Dr. Astrid Bauer
Laufzeit: 01.01.2003 – 31.12.2007
Finanzierung: Bayerisches Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten
Förderkennzeichen: A/98/05